一般熒光顯微鏡均采用柯勒照明。所謂柯勒照明是一種能夠得到圖像Z大對比和Z大分辨的折中方法。這時，燈絲成像在孔徑光闌上，一般也成像在物鏡Z后一片鏡框上。孔徑光闌是限制光源大小的光闌，而視場光闌是限制人眼在目鏡里看到視野大小的光闌。只有在正確校準柯勒照明的條件下，熒光顯微鏡才能獲得它的更合適的光學性能。

柯勒照明校準方法如下：

①調焦：把樣品放在工作臺上，沿光軸方向移動工作臺或物鏡，對樣品進行調焦，使成像清晰。

②打開孔徑光闌，把孔徑光闌開到Z大。

③關小視場光闌，于是在視場里可以看到視場光闌的影子，即周圍一圈變暗，只有中間是亮的。調節聚光鏡上下位置，使視場光闌邊緣清晰。調節聚光鏡上調中螺絲，使視場光闌居

④減小孔徑光闌，一直到視場里看到Z好的像為止，一般孔徑光闌為其Z大時的70%。