熒光顯微鏡比普通顯微鏡復雜，使用也比較麻煩，但只要注意下面幾點，用戶自行作些校準還是很容易的。

1、汞燈的校準

基于熒光顯微鏡的原理，決定了選用汞燈作為其光源。由于標本產(chǎn)生的熒光比較弱，為了得到較亮的圖像，汞燈的校準至關(guān)重要。具體校準步驟如下：

①開啟汞燈后，在熒光顯微鏡工作臺上放一張白紙，并從物鏡轉(zhuǎn)換器中轉(zhuǎn)出物鏡，即轉(zhuǎn)換器上出現(xiàn)的空孔位于光軸上，卸去轉(zhuǎn)換器上保護蓋(如無空孔，可卸掉一個低倍物鏡，校準完畢后再旋上)。轉(zhuǎn)動熒光顯微鏡主體內(nèi)的濾光片座，選一個透過綠光的濾光片組，使反射照明有光通過物鏡轉(zhuǎn)換器孔，此時在白紙上可以看到汞燈照亮的光斑。如光斑太亮，可以插入中性濾光片，或帶上太陽眼鏡，以保護眼睛。

②轉(zhuǎn)動聚光鏡調(diào)焦旋手，使汞燈光弧在白紙上成像清晰。因汞燈室內(nèi)裝有一個球面反光鏡，用來增加亮度，于是在白紙上看到兩個光弧的像。旋轉(zhuǎn)汞燈調(diào)節(jié)旋手和反光鏡位置調(diào)節(jié)旋手，使兩個光弧并立。再轉(zhuǎn)動反光鏡聚焦調(diào)節(jié)旋手，使兩個光弧有接近相等的亮度。

③旋轉(zhuǎn)汞燈調(diào)節(jié)旋手和反光鏡位置調(diào)節(jié)旋手，使兩個光弧重合。再調(diào)節(jié)聚光鏡調(diào)焦旋手，得到放大和均勻的光弧像。這樣汞燈校準工作就完成了。轉(zhuǎn)入物鏡后，根據(jù)物鏡具體倍率，稍微調(diào)節(jié)一下聚光鏡調(diào)焦旋手就可以了。

2、孔徑光闌和視場光闌的校準

一般熒光顯微鏡均采用柯勒照明。所謂柯勒照明是一種能夠得到圖像Z大對比和Z大分辨的折中方法。這時，燈絲成像在孔徑光闌上，一般也成像在物鏡Z后一片鏡框上。孔徑光闌是限制光源大小的光闌，而視場光闌是限制人眼在目鏡里看到視野大小的光闌。只有在正確校準柯勒照明的條件下，熒光顯微鏡才能獲得它的Z佳光學性能。

柯勒照明校準方法如下：

①調(diào)焦：把樣品放在工作臺上，沿光軸方向移動工作臺或物鏡，對樣品進行調(diào)焦，使成像清晰。

③關(guān)小視場光闌，于是在視場里可以看到視場光闌的影子，即周圍一圈變暗，只有中間是亮的。調(diào)節(jié)聚光鏡上下位置，使視場光闌邊緣清晰。調(diào)節(jié)聚光鏡上調(diào)中螺絲，使視場光闌居中。然后再調(diào)大視場光闌，使它略大于目鏡視場。

④減小孔徑光闌，一直到視場里看到Z好的像為止，一般孔徑光闌為其Z大時的70%。