得益于民用和商業照明領域的進展，顯微鏡所用的照明技術也不斷更新。相比于普通光學顯微鏡，熒光顯微鏡對光源的要求更高。

熒光顯微鏡的主要原理是：光源的光經過激發片的過濾，得到激發光；激發光照射到樣品上，樣品受激發而發射出熒光；二向分光鏡可以同時反射激發光，和透射熒光。

有些樣品自身可以發出熒光；更多樣品自身不能發熒光，但是經過染色后，也可以發出熒光。只有對特定波長的入射光，這些染色劑才能發出熒光。因此作為熒光顯微鏡的光源，首先需要滿足染色劑的波段要求。其次，由于熒光相對于入射光較為微弱，因此光源需要有足夠高的亮度。

常用的熒光光源有汞燈、氙燈、激光和LED。傳統光源具有如下特點:

汞燈優點：多個譜峰，非相干光源，價格合理，發光表面緊湊

汞燈缺點：發熱過多，壽命短，產生臭氧，需要激發片和發射片，難以調節

氙燈優點：寬光譜，非相干光源，價格合理，發光表面緊湊

氙燈缺點：發熱過多，壽命較短，產生臭氧，需要激發片和發射片，難以調節

激光優點：單色譜線，每條譜線的功率高，相對長的壽命，發光表面緊湊

激光缺點：發熱過多，價格高，相關光源，需要發射片，需要高電壓，難以調節

相比傳統光源，LED具有諸多優勢。如長壽命、發熱少、非相關光源、低電壓運行。在使用上，LED光源可以即開即關，而不影響其壽命，一通電馬上就能達到全光強，不像傳統光源那樣需要長時間的預熱。當使用單色LED時，激發片就不是必要的了，這樣設計出來的熒光顯微裝置結構可以更簡單。如果樣品只有一種熒光，而且沒有自發熒光干擾，那么發射片也可以省略。

按照“海茲定律”，每經過10 年，LED輸出流明將提升20倍，同時LED的成本價格將降1/10。在這種趨勢下，LED光源成為熒光顯微鏡的主流光源是不可避免的。