熒光顯微鏡采用透射激發時，可以使用蘭色光線根據普通明場照明法進行照明系統的調節，這包括光源調節及聚光鏡中心的調節。如果采用暗場聚光鏡，則還需要注意暗場聚光鏡的使用及調節方法，當用蘭色光線調節好后，就可采用更換濾色片的方法，使標本得到所需要的激發光線照射標本，但要注意使遏止濾光片已在光路中，這樣可以保護觀察者眼睛免受紫外線損傷。

熒光顯微鏡采用反射激發時，先在光路中加入綠色激發濾光片組，把照明可變孔徑光闌與視場光闌完全打開，調節光源位置，使照明光束通過物鏡轉換器的螺孔中央并使光源成象于物平面上，此時物鏡螺孔應是通孔（不裝物鏡）。檢查激發光束是否通過物鏡螺孔中央，可在螺孔端面上放置半透明紙觀察光源光斑是否居中，在某些熒光顯微鏡中，光源是在垂直面內調節其上下左右位置，而光源成象是通過集光鏡沿軸方向移動來達到的。

熒光顯微鏡在安裝光源時要注意光源表面不能沾污手指印及其他斑痕，以免點燃過后，難以清潔，因此，新安裝光源時，使用前燈殼表面可用紗布蘸上酒精等有機溶劑揩檫干凈，此外，還需要注意電極方向，根據光源要求進行安裝，以免發生意外或點燃不亮，燈管應裝入燈箱內方可點燃，以防萬一爆炸傷人。激發濾光片及遏止濾光片如何組合使用應根據不同熒光標本的激發方法進行選擇，一般也可根據使用說明書推薦的配套方法進行選用。