在生物科研與教學(xué)領(lǐng)域，體視顯微鏡以其立體成像、大景深和操作便捷性，成為觀察生物樣品宏觀形態(tài)與微觀細(xì)節(jié)的核心工具。無(wú)論是昆蟲(chóng)解剖、植物表型分析，還是細(xì)胞培養(yǎng)監(jiān)控，規(guī)范的樣品制備流程直接決定成像質(zhì)量。本文系統(tǒng)梳理生物樣品制備的關(guān)鍵技術(shù)節(jié)點(diǎn)，結(jié)合不同樣品類型提供針對(duì)性解決方案，助力研究者突破觀測(cè)瓶頸。

一、樣品前處理：從活體取材到基礎(chǔ)固定

活體取材與即時(shí)觀察

昆蟲(chóng)樣本：采用CO?麻醉法處理果蠅、蠶等模式生物，麻醉后用昆蟲(chóng)針固定于軟質(zhì)蠟盤(pán)，保持肢體自然伸展。

植物組織：取新鮮葉片、花蕾或莖段，用濕棉球包裹根部維持活性，直接置于載物臺(tái)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察（如氣孔開(kāi)閉）。

水生生物：浮游生物樣本需用篩網(wǎng)過(guò)濾后，以5%甘油水溶液懸浮，防止脫水變形。

化學(xué)固定與形態(tài)保存

通用固定液：4%多聚甲醛（PFA）適用于大多數(shù)生物組織，室溫固定10-30分鐘，可保持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性。

特殊樣本處理：含多酚類物質(zhì)（如番茄果實(shí)）需用真空滲透法固定，避免組織褐變；柔軟樣本（如腦組織）需用瓊脂糖包埋后再固定。

二、精密制片技術(shù)：針對(duì)不同樣品類型的解決方案

整體裝片法

適用場(chǎng)景：昆蟲(chóng)觸角、植物根尖等宏觀結(jié)構(gòu)觀察。

操作要點(diǎn)：將樣品直接放置于載玻片，滴加PBS緩沖液保持濕潤(rùn)，用0.17mm蓋玻片覆蓋，避免氣泡產(chǎn)生。

進(jìn)階技巧：對(duì)透明樣本（如果蠅翅膀）可滴加1%亞甲基藍(lán)溶液，增強(qiáng)組織輪廓對(duì)比度。

臨時(shí)切片法

硬質(zhì)材料：木材、骨骼等需用滑動(dòng)式切片機(jī)制作50-100μm厚切片，切片前用火棉膠包埋增強(qiáng)硬度。

柔嫩組織：采用“膠帶法”制備洋蔥表皮等單層細(xì)胞樣本，將透明膠帶粘附于組織表面后剝離，反貼于載玻片。

含液樣本：植物莖稈切片后需用吸水紙吸除乳汁，避免污染鏡頭。

活細(xì)胞動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

培養(yǎng)皿直接觀測(cè)：將細(xì)胞接種于35mm玻璃底培養(yǎng)皿，體視顯微鏡下可連續(xù)觀察72小時(shí)，配合溫控裝置維持37℃環(huán)境。

微流控芯片集成：將細(xì)胞接種于帶有通道的芯片，通過(guò)液體灌注模擬體內(nèi)微環(huán)境，實(shí)現(xiàn)藥物刺激下的實(shí)時(shí)響應(yīng)追蹤。

三、成像優(yōu)化策略：從照明調(diào)節(jié)到三維重構(gòu)

照明模式選擇

反射光照明：適用于昆蟲(chóng)復(fù)眼、植物表皮等不透明樣品，通過(guò)環(huán)形LED光源實(shí)現(xiàn)無(wú)陰影照明。

透射光照明：觀察水蚤、輪蟲(chóng)等透明生物時(shí)，采用底光式LED光源，配合中性密度濾光片降低光強(qiáng)。

斜射光技術(shù)：對(duì)表面紋理豐富的樣本（如昆蟲(chóng)翅膀），傾斜45°入射光可突顯微觀刻痕。

三維觀察與測(cè)量

Z軸層掃：通過(guò)電動(dòng)載物臺(tái)實(shí)現(xiàn)0.5μm步進(jìn)層掃，結(jié)合軟件可重構(gòu)樣品三維形貌（如種子胚乳結(jié)構(gòu)）。

體尺測(cè)量：使用標(biāo)定尺對(duì)昆蟲(chóng)體長(zhǎng)、植物器官尺寸進(jìn)行精確測(cè)量，誤差控制在2%以內(nèi)。

四、特殊樣品處理：從超薄結(jié)構(gòu)到活體操作

超薄樣品制備

臨界點(diǎn)干燥：對(duì)花粉粒、孢子等微小樣本，采用CO?臨界點(diǎn)干燥儀處理，避免常規(guī)干燥導(dǎo)致的形態(tài)收縮。

噴金處理：干燥后樣品需濺射鍍膜（10nm金/鉑），消除表面電荷積累，提升成像信噪比。

活體操作技術(shù)

顯微注射：在體視鏡下將玻璃針插入斑馬魚(yú)胚胎，注射CRISPR-Cas9試劑，操作精度達(dá)1μm。

細(xì)胞移植：使用毛細(xì)管微操器轉(zhuǎn)移單個(gè)細(xì)胞，配合電動(dòng)載物臺(tái)實(shí)現(xiàn)跨胚層細(xì)胞移植。

五、常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案

成像模糊：檢查物鏡是否沾染指紋，或樣品表面存在油脂，需用90%乙醇擦拭清潔。

色彩失真：LED光源老化導(dǎo)致色溫偏移，需定期用色卡校準(zhǔn)（推薦X-Rite ColorChecker）。

樣品漂移：活體觀察時(shí)啟用載物臺(tái)加熱功能（37℃），減少溫差引起的樣本蠕動(dòng)。

六、前沿技術(shù)拓展：自動(dòng)化與多模態(tài)融合

隨著技術(shù)發(fā)展，體視顯微鏡正朝著智能化、多功能方向演進(jìn)：

AI輔助制樣：通過(guò)機(jī)器視覺(jué)自動(dòng)識(shí)別樣品類型，推薦Z佳制片流程（如固定時(shí)間、染色劑濃度）。

光片照明顯微鏡：結(jié)合體視鏡與光片照明技術(shù)，實(shí)現(xiàn)毫米級(jí)樣本的快速三維成像（如斑馬魚(yú)全腦神經(jīng)投射）。

高質(zhì)量的體視顯微鏡觀測(cè)始于嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臉悠分苽洹Ｍㄟ^(guò)優(yōu)化取材、固定、制片、成像全流程工藝，結(jié)合樣品特性選擇適配方案，研究者可充分揭示生物樣品的形態(tài)學(xué)特征。